Estandarización de la técnica reacción en cadena de la polimerasa para la detección molecular de Giardia intestinalis en muestras de heces

Abstract

Las técnicas moleculares son una excelente alternativa para el diagnóstico de giardiasis, producida por Giardia intestinalis, pero se requiere evaluar y determinar la mejor diana de amplificación, condiciones óptimas de reactivos, así como la estandarización de un protocolo de PCR para su detección. El objetivo del presente trabajo se basó en la estandarización de una PCR para la detección molecular del parásito basándose en dos dianas de amplificación (Catepsina L y el gen codificante del ARN ribosomal 18S) y estandarización de la PCR donde se obtuvieron mejores resultados. Para la extracción de ADN se utilizó el estuche comercial de Promega, Wizard® Genomic DNA Purification Kit a partir de muestras de heces el cual permitió obtener ADN de gran pureza e integridad. La diana ideal fue la correspondiente al gen codificante del ARN ribosomal 18S, por lo que se estandarizaron las condiciones de la reacción de esta PCR (concentración de reactivos, temperatura de hibridación y número de ciclos). Se determinó la sensibilidad analítica y especificidad de la técnica. Las condiciones óptimas para la PCR fueron: MgCl2 1,5 mM, dNTPs 100 µM, BSA 1 mg/mL, cebadores 0,2 M, ADN Polimerasa 0,75 U, utilizando 35 ciclos y una temperatura de hibridación de 57 °C. La sensibilidad analítica de la PCR fue de 10 fg y la especificidad fue del 100%, por lo que es altamente sensible y específica para la detección de ADN de Giardia intestinalis