Clonación y expresión del gen codificante de la proteína de choque térmico HSP85 de Trypanosoma cruzi

Abstract

Tryapanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, es un parásito que presenta alternancia morfológica entre un hospedador invertebrado (triatomino) y vertebrado (mamífero). Se ha implicado la participación de las proteínas de choque térmico en los cambios morfológicos y funcionales durante situaciones de estrés en células eucariotas superiores. En particular las proteínas de choque térmico de 90 kDa (HSP90) se encuentran involucradas en numerosos procesos intracelulares en células eucarióticas. Estudios realizados recientemente han demostrado que en T. cruzi la Hsp85 (homóloga de HSP90) es esencial para la división celular y en control de la respuesta al estrés térmico. En el presente trabajo se logró clonar y expresar por primera vez el gen codificante de la proteína de choque térmico Hsp85 de T. cruzi. Se realizó la extracción de ARN de T. cruzi, a partir de masas de epimastigotas mediante el empleo de dos estuches comerciales: TRI®Reagent Sigma y Viral NucleicAcid Extraction Kit (FavorPrep™). Los resultados indicaron que el estuche comercial FavorPrepTM permitió la obtención de ARN con mayor grado de pureza. Se obtuvo el ADNc codificante de la Hsp85, a partir del ARNm extraído, para ello se diseñaron los cebadores con base en la secuencia de hsp85 de T. cruzi cepa CL Brener de 2115 pb (T. cruzi strain CL Brener heat shock protein 85) obtenida del GenBank (N° acceso XM_809799). Se obtuvo la amplificación de una banda con un tamaño aproximado de 2150 pb mediante RT-PCR. Se realizó la clonación en el vector de mantenimiento pGEM®T-Easy. Se subclonó en varios vectores de expresión, pRSET, pCITE, pTrcHis2 y pGEX4T los cuales no mantuvieron el ADNc hsp85 de T. cruzi, quizás por ser sistemas complejos que puede hacer a la construcción plásmido-hsp85 inestable para la célula bacteriana. Se realizó la estrategia de subclonación “en ciego” sin verificación, lo cual permitió obtener colonias recombinantes con el vector de expresión pQE30. Posterior a 3 horas de inducción con IPTG se obtuvo una proteína recombinante con un peso molecular (PM) aproximado de 82 kDa (PM esperado para la secuencia clonada), también se observaron otras dos bandas de menor tamaño, que pudiesen ser la misma molécula, pero truncada por degradación por parte de la célula bacteriana. Se purificó la proteína recombinante mediante cromatografía de afinidad, obteniendo bajo rendimiento. Sin embargo, la reacción de inmunobloting con el suero hiperinmune anti-epimastigota de T. cruzi permitió la identificación de una sola banda con un PM aproximado de 82 kDa, indicando en este caso una reacción específica con la proteína recombinante obtenida durante el presente trabajo.